Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC): ¿Qué es?

La cromatografía de líquido involucra métodos o técnicas especializadas, como en el caso de la HPLC y la iónica, que viene siendo básicamente un procedimiento de separación, que se utiliza para reconocer, cuantificar y purificar los diversos componentes de una respectiva mezcla.

Es una herramienta de gran potencia en el sector de química analítica. Viene siendo considerado como uno de los instrumentos más comunes dentro del laboratorio. Se trata de una técnica donde la fase móvil es líquida. Sobre este tema, estaremos tratando esta técnica y su importancia para la gestión de datos y la validación de instrumentos.

¿Cómo funciona la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)?

En la HPLC la muestra de mezcla se pasa conjuntamente con un disolvente líquido a elevada presión, mediante una columna que contiene un material absorbente sólido. En este caso, la presión aumenta con ayuda de bombas. Al respecto, el principio de funcionamiento consiste en que cada uno de los compuestos en la mezcla puede interactuar de forma diferente con el material absorbente en la columna, lo que permite generar velocidades de flujo variables para los diferentes componentes.

De esta manera, se conduce la separación de los mismos a medida que salen de la columna. El material absorbente usado tiende a ser granular, compuesto por partículas sólidas, como en el caso del sílice, que forman la etapa estacionaria. El líquido a presión es una combinación de disolventes como líquidos orgánicos y agua, que hacen la fase móvil.

Los compuestos separados se pueden visualizar como picos con el número de picos correspondiente a la cantidad de componentes separados en la mezcla. La superficie del pico es proporcional a la concentración del compuesto que se encuentra presente en dicha mezcla.

Es de saberse que, la resolución entre dos picos bajo esta técnica, viene siendo el grado en el cual la sustancia se puede llegar a separar durante el experimento. Una resolución más alta, lo que hace reflejar una separación de los compuestos de manera efectiva.

¿Por qué utilizar la HPLC?

La HPLC es una técnica asequible y versátil. Cuenta con varias ventajas como en el caso de la administración de datos y la validación de instrumentos. Para su mayor aprovechamiento, se pueden considerar los siguientes aspectos:

Cromatografía líquida de rendimiento ultra alto (UHPLC)

La UHPLC viene siendo una variante de la HPLC, que se caracteriza por usar partículas más pequeñas, con el propósito de mejorar el rendimiento cromatográfico. Esta amerita de presiones más elevadas por lo que, como sucede con la HPLC, los contaminantes del agua pueden tener un impacto negativo en los resultados.

Pero, debido a las mayores sensibilidades que puede tener este tipo de técnicas, el efecto tiende a ser más extremo.

Cromatografía iónica

Esta técnica permite la separación de moléculas polares e iones, en función de su interacción con una columna específica de medios de intercambio iónico. Esta técnica se puede implementar para casi cualquier tipo de molécula cargada, incluyendo los nucleótidos pequeños, proteínas grandes y aminoácidos. Además, se usa, en gran medida, para la determinación de cationes y aniones tanto orgánicos como inorgánicos.

El impacto del agua

La calidad del agua usada como reactivo puede llegar a afectar a casi todos los aspectos del análisis de la HPLC, desde la preparación de muestras y estándares hasta la elusión y enjuague de las columnas. Esto transforma al agua en el reactivo más consumido para este tipo de técnicas, haciendo uso de equipos de laboratorio adecuados.

Generalmente, los problemas de rendimiento de HPLC se generan debido a la mala calidad del agua usada en la preparación de estándares, eluyentes y muestras del agua de HPLC. El agua que es de mala calidad o se encuentra contaminada puede afectar indiscutiblemente la resolución al introducir picos fantasmas, alterar la selectividad de la etapa estacionaria y afectar las líneas de referencia durante el proceso de separación cromatográfica.

¿Cuáles son los diferentes tipos de contaminantes en el agua que afectan a los resultados de HPLC?

Compuestos orgánicos

La contaminación por parte de compuestos orgánicos del agua ultrapura puede llegar a tener un efecto importante sobre la separación cromatográfica de varias formas:

Reducción de la vida útil de la columna

Las moléculas orgánicas que están vinculadas a la superficie de la columna pueden llegar a ralentizar el acceso de las moléculas de muestra y solvente, en los respectivos lugares de vinculación en la perla de la columna o etapa estacionaria. Como resultado de ello se genera una reducción de la capacidad de la columna para llegar a producir la separación de los compuestos o pérdida de resolución y una menor vida útil de la misma.

Reducción de sensibilidad

Las moléculas orgánicas en el agua eluyente pueden llegar a competir con las moléculas de la muestra para asociarse con las perlas de la columna o la etapa estacionaria. De esta manera, se reduce la cantidad de moléculas de muestra que puede estar relacionado con la columna y, por ende, se genera la disminución de la cantidad de moléculas liberadas durante el respectivo proceso de elusión.

Datos imprecisos

Es posible conseguir picos fantasmas de los contaminantes, a partir de los compuestos orgánicos que se llegan a acumular en el cabezal de la columna y después se recogen como el eluyente.

Calificación operacional cromatógrafos (HPLC)

Son varias las técnicas que se pueden distinguir en la cromatografía. Pero, la HPLC, viene siendo una de las más usadas. En Quimitronica adoptamos una política de mejora constante y capacitación permanente, con el propósito de garantizar un servicio excepcional y satisfacer las demandas en evolución de nuestros clientes.

Si tienen interés en conocer más sobre aseguramiento metrológico u otro tipo de técnica especializada, pueden contactarnos al PBX: (601) 534 3848.